1 — La lumière
En microscopie photonique, tout repose sur la lumière. Ce que nous observons au microscope, c'est la lumière que les objets réfléchissent, transmettent ou émettent. Pour comprendre comment un microscope forme une image, il faut d'abord comprendre la nature de la lumière et l'énergie qu'elle transporte.
1.1 Qu'est-ce que la lumière ?
La lumière est à la fois une onde électromagnétique et un flux de particules (photons). Dans le vide, elle se propage en ligne droite à la vitesse c = 3 × 10⁸ m/s. Elle est entre autre caractérisée par sa longueur d'onde λ (lambda), exprimée en nanomètres (nm). Le spectre visible s'étend d'environ 380 nm (violet) à 700 nm (rouge).
1.2 La longueur d'onde λ
La longueur d'onde λ est la distance entre deux pics consécutifs d'une onde électromagnétique. Ce paramètre détermine la couleur du rayonnement lumineux. Dans le spectre visible, les longueurs d’onde les plus courtes correspondent aux couleurs froides (violet, bleu), tandis que les plus longues correspondent aux couleurs chaudes (orange, rouge). Une lumière monochromatique (comme celle d’un laser) est caractérisée par une longueur d’onde unique : par exemple, un laser bleu utilisé en microscopie a classiquement une longueur d’onde d’environ 488 nm. À l’inverse, certaines sources comme le Soleil ou les lampes à large spectre émettent une lumière polychromatique, composée de plusieurs longueurs d’onde. Le mélange de ces couleurs est alors perçu comme de la lumière blanche.
Simulation A — L'onde lumineuse
Déplacez le curseur pour changer la longueur d'onde. La couleur et la période de l'onde se mettent à jour en temps réel.
1.3 Dualité onde-corpuscule
La lumière possède une double nature : ondulatoire (comme illustré ci-dessus) et corpusculaire. En tant que particule, elle est constituée de photons — des grains discrets d'énergie. C'est cette nature corpusculaire qui régit les interactions avec la matière : pour qu'une molécule absorbe de la lumière, elle doit capter un photon entier d’énergie appropriée. C'est ce phénomène qui est à la base de la fluorescence.
1.4 Fréquence et énergie
La fréquence f (ou ν) est le nombre de cycles de l'onde par seconde, exprimée en hertz (Hz). Elle est liée à la longueur d'onde par :
1.5 Longueur d'onde et énergie des photons
La relation fondamentale est :
Cette formule a une conséquence simple mais capitale : plus la longueur d'onde est courte, plus l'énergie du photon est grande. Un photon violet (400 nm) transporte presque 75% d'énergie en plus qu'un photon rouge (700 nm).
Lors de la fluorescence, un fluorochrome absorbe un photon d'excitation, puis en réémet un autre (émission). Entre les deux, une partie de l'énergie est perdue sous forme de chaleur (relaxation vibrationnelle). Le photon émis a donc moins d'énergie que le photon absorbé, ce qui signifie qu'il a une longueur d'onde plus grande (plus vers le rouge). C'est le décalage de Stokes : λémission > λexcitation.
En pratique : la GFP est excitée à 488 nm (bleu-cyan) et émet à 507 nm (vert). On ne peut jamais émettre à une longueur d'onde plus courte que l'excitation — c'est physiquement impossible en fluorescence ordinaire (contrairement à la microscopie multiphotonique utilisant 2 ou 3 photons comme source d'excitation).
Simulation B — Spectre visible & énergie des photons
Cliquez ou glissez sur le spectre pour sélectionner une longueur d'onde. Observez comment l'énergie du photon varie.