Introduction à la microscopie confocale

5 — Détection & Résolution

5.1 La PSF (Point Spread Function)

La lumière émise a une manière bien spéciale de se propager dans l'espace. Ainsi, l'image d'un point (que l'on pourrait représenter par une bille infiniment petite) est une forme géométrique particulière appelée la fonction d'étalement du point (Point Spread Fonction, PSF). Elle est caractérisée par un étalement latéral (XY) et un étalement axial (Z) bien plus important. C'est une fonction mathématique entièrement déterminée par λ et NA — ce qui signifie qu'on peut la modéliser (et même l'inverser pour corriger numériquement le flou de l'image : c'est le principe de la déconvolution).

5.2 Disque d'Airy et limite de résolution

Le critère de Rayleigh définit la limite à laquelle deux points peuvent être distingués. La distance minimale de résolution est donnée par la formule : r = 0.61λ / NA.

5.3 Échantillonnage de Nyquist

Afin de capturer les plus petits détails résolus par l'objectif, le théorème de Nyquist suggère, pour le détecteur, une taille de pixel 2.3 fois inférieure à la résolution de l'objectif. Ainsi, pour un objectif dont la résolution est 230nm, on fixera la taille du pixel à 100nm pour être certain d'exploiter au maximum les capacités de ce dernier. Si les pixels sont plus gros, moins de détails pourront être capturés, s'ils sont plus petits, du bruit apparaitra sans gain de résolution. Taille pixel optimale = r / 2.3.

• Sous-échantillonnage : Pixels trop grands, perte de détails (aliasing).
• Sur-échantillonnage : Pixels trop petits, bruit excessif sans gain de résolution réelle.

5.4 Le pinhole (Trou de conjugaison)

En microscopie confocale, le pinhole rejette la lumière provenant des plans hors-focus, améliorant la résolution et permettant le sectionnement optique. La taille optimale est généralement de 1 AU (Airy Unit).

Sectionnement et résolution

Le pinhole agit comme un filtre spatial. En se fermant, il élimine la "tache" de diffraction hors-focus (les ailes de la PSF) pour ne laisser que le cœur du point focal.

5.5 Les détecteurs

Le détecteur convertit les photons en signal électrique. Le choix du détecteur impacte la sensibilité (capacité à détecter peu de photons), la dynamique (écart entre signal min et max) et la vitesse d'acquisition.

Le photomultiplicateur (PMT)

Le PMT est le détecteur historique du microscope confocal. Un photon frappe une photocathode et libère un électron, qui est ensuite amplifié en cascade à travers une série de dynodes. Chaque dynode libère plusieurs électrons supplémentaires. Ce processus génère un signal mesurable à partir d'un seul photon. Son efficacité quantique (QE) est d'environ 15–20 %, ce qui signifie que sur 100 photons reçus, seuls 15 à 20 génèrent un signal. C'est le détecteur standard de la grande majorité des confocaux en service aujourd'hui.

Le détecteur hybride (HyD)

Le HyD remplace les dynodes du PMT par une diode à avalanche, couplée à une photocathode en GaAsP. Son efficacité quantique atteint ~45 %, soit environ trois fois supérieure à celle d'un PMT classique. Cette sensibilité accrue permet de travailler avec des puissances laser très faibles, réduisant le photoblanchiment. Le HyD peut également fonctionner en mode comptage de photons (photon counting) : chaque photon génère une impulsion électrique discrète plutôt qu'un signal analogique continu. C'est le mode privilégié pour le FLIM et l'imagerie de signaux extrêmement faibles.

Le sCMOS

Contrairement au PMT et au HyD qui détectent la lumière point par point (le laser balaie l'échantillon), le sCMOS est un capteur matriciel composé de millions de pixels qui capturent simultanément tout le champ de vue. Son bruit de lecture est très faible et sa vitesse d'acquisition très élevée, ce qui le rend idéal pour l'imagerie en champ large (widefield) et le spinning disk confocal. Il n'est pas utilisé en confocal point scanning classique.