Section 2 : La fluorescence

2 — La fluorescence

2.1 Photoluminescence

La photoluminescence désigne l'émission de lumière par une molécule après absorption d'un photon. Elle regroupe deux phénomènes distincts selon la nature de l'état excité impliqué :

Fluorescence — L'émission est quasi instantanée (τ ≈ 1–10 ns). L'électron excité revient à l'état fondamental sans changer de spin (transition singulet → singulet S₁ → S₀). L'émission cesse dès que l'excitation s'arrête.

Phosphorescence — L’émission persiste bien après l’arrêt de l’excitation, de quelques millisecondes à plusieurs secondes. Elle implique un changement de spin (transition triplet → singulet) et correspond au principe des objets « glow in the dark ». En microscopie à fluorescence, ce phénomène est anecdotique et généralement non exploité.

En microscopie de fluorescence, on exploite exclusivement la fluorescence pour sa rapidité, sa spécificité et sa reproductibilité.

2.2 Diagramme de Jablonski

Le diagramme de Jablonski représente les niveaux d'énergie électroniques et vibrationnels d'un fluorophore. Cliquez sur chaque flèche pour en savoir plus.

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Diagramme de Jablonski — états électroniques et vibrationnels d'un fluorophore

2.3 Décalage de Stokes

Après l’absorption d’un photon d’excitation, la molécule excitée perd une partie de son énergie par relaxation vibrationnelle, sous forme de chaleur, avant l’émission lumineuse. Le photon émis (hν') est donc moins énergétique que le photon absorbé (hν), ce qui correspond à une longueur d’onde plus grande :

λ_émission > λ_excitation

Cette différence de longueur d’onde, appelée décalage de Stokes (Δλ), permet de séparer spectralement l’excitation de l’émission, un point essentiel pour filtrer le signal fluorescent en microscopie.

Spectres d'excitation (bleu pointillé) et d'émission (vert) de la GFP — décalage de Stokes

Exemple GFP : La GFP présente un pic d’excitation à 488 nm et un pic d’émission à 507 nm, soit un décalage de Stokes d’environ Δλ≃19 nm. Cet écart permet d’utiliser un filtre passe‑bande centré sur 507 nm pour détecter la fluorescence tout en bloquant efficacement la lumière du laser d’excitation à 488 nm.

Simulation — Excitation et collecte du signal de la GFP

Cette simulation illustre l’impact du choix de la longueur d’onde d’excitation et du filtre d’émission sur l’intensité du signal fluorescent collecté. Déplacez le laser et le filtre pour voir leur impact sur le signal fluorescent collecté.

Position laser 488 nm

Filtre passe-bande (centre, Δ = 30 nm) 507 nm

—Excitation

—Collection

—Signal

Cellule

Signal : —

2.4 Caractéristiques d'un fluorophore

Paramètre	Symbole	Définition	FITC vs Alexa647
Coefficient d'absorption molaire	ε	Capacité à absorber les photons à une longueur d’onde donnée (L·mol⁻¹·cm⁻¹)	FITC : 73 000 / Alexa647 : 270 000
Efficacité quantique	QY	Fraction des photons absorbés qui sont réémis (0–1)	FITC : 0,92 / Alexa647 : 0,33
Brillance	ε × QY	Signal émis par molécule — indicateur direct de la détectabilité en microscopie	FITC : 67 000 / Alexa647 : 89 100
Lifetime	τ	Temps à 1/e de l'intensité après excitation pulsée (ns)	FITC : ~4 ns / Alexa647 : ~1 ns
Photostabilité	—	Résistance au photoblanchiment sous illumination continue	Alexa Fluor >> FITC

Lifetime et FLIM : Deux fluorophores peuvent présenter des spectres d’excitation et d’émission très similaires tout en ayant des lifetimes différents. La microscopie FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) exploite cette propriété pour les distinguer, ou pour mesurer des paramètres biophysiques locaux (pH, viscosité, interactions FRET), indépendamment de l’intensité absolue du signal.

2.5 Types de fluorophores

Fluorophores organiques

Petites molécules synthétiques (Alexa Fluor, FITC, DAPI, Cy3, Cy5…). Grande variété spectrale, haute brillance. Nécessitent une fixation ou une conjugaison à un anticorps / ligand. Certains sont capables de traverser la membrane plasmique, d'autres ont besoin que cette dernière soit perméabilisée.

ADN et microtubules — ADN + Microtubules

Protéines fluorescentes

Majoritairement dévirées de la GFP, elles peuvent être integrées au génome par ingénérie moléculaire, et donc être exprimées dans des organismes vivants. Elles peuvent être fusionnées à une protéine d'interet pour la localiser ou suivre son déplacement.

Applications GFP — Bhatt et al., PNAS 2009, doi:10.1073/pnas.0904061106

Quantum dots

Nanocristaux semi-conducteurs (CdSe, InP…). Spectre d'émission très étroit accordable par la taille du nanocristal. Spectre d'excitation large. Excellente photostabilité — idéaux pour le multiplexage et le suivi longue durée.

2.6 Séparation excitation / émission dans un microscope à fluorescence

En microscopie à fluorescence, le principal défi expérimental consiste à séparer la faible lumière émise par le fluorophore de la lumière d’excitation, beaucoup plus intense. Cette séparation est rendue possible grâce au décalage de Stokes et à une combinaison de filtres spectraux et d’un miroir dichroïque.

Éléments optiques clés du microscope à fluorescence :

Filtre d’excitation — sélectionne une bande étroite de longueurs d’onde correspondant au spectre d’absorption du fluorophore (ex. 488 nm pour la GFP).
Miroir dichroïque — réfléchit la lumière d’excitation vers l’échantillon et transmet la lumière d’émission vers le détecteur.
Filtre d’émission — bloque la lumière d’excitation résiduelle et ne laisse passer qu’une bande spectrale centrée sur l’émission du fluorophore (ex. 507 ± 15 nm pour la GFP).

Les filtres d'émission/détection sont caractérisés par deux valeurs : la première correspond à la longueur d'onde au centre du filtre, et la seconde à la large du filtre. Ainsi, un filtre 580/20 est centré sur 580nm et a une largeur totale de 20nm. Il laisse donc passer la lumière de 570 à 590nm. Cette notation est universelle.

Spectre d'émission de la tdTomato avec filtre d'émission superposé — Spectre d'émission de la tdTomato (orange) avec le filtre d'émission centré sur le pic d'émission. Seule la lumière dans la bande passante du filtre atteint le détecteur.

Sans ce système, le rayon d'excitation (beaucoup plus intense que l'émission du fluorophore) serait perçu par le detecteur et noierait le signal du fluorophore. Cette architecture optique permet donc de maximiser le rapport signal/bruit.

2.7 Photoblanchiment

Le photoblanchiment (photobleaching) est la perte irréversible de fluorescence par destruction du fluorophore. Une excitation trop forte, une exposition prolongée ou répétée, ou des conditions environnementales défavorables (pH, température, présence d'oxygène) peuvent altérer irrémédiablement la structure du fluorophore et supprimer toute émission.

Comment limiter le photoblanchiment :

Réduire la puissance laser au minimum nécessaire
Limiter le temps d'exposition et le nombre d'acquisitions
Utiliser des agents antifade (Mowiol + DABCO, ProLong Gold, Trolox)

2.8 Autofluorescence

Certaines molécules biologiques possèdent une fluorescence intrinsèque : elles émettent naturellement de la lumière lorsqu'elles sont excitées par un laser. C'est l'autofluorescence. Les principales sources d'autofluorescence en biologie cellulaire sont le NADH, le FAD et la kératine dans les tissus. D'autres molécules peuvent contribuer selon le type d'échantillon. Ceci pose un problème, car cette autofluorescence génère un signal en plus de celui de nos fluorophores, ce qui contribue à diminuer le ratio signal/bruit : c'est le bruit de fond. On l'observe davantage dans les courtes longueurs d'ondes et de moins en moins lorsqu'on regarde vers le rouge. Pour y remédier, on peut sélectionner des fluorophores émettant dans le rouge, utiliser des contrôles négatifs pour caractériser le bruit de fond, et limiter l'excitation.

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